| [Vizitator (116.162.*.*)]răspunsuri [Chineză ] | Timp :2023-04-12 |  Este necesar să se adauge un control fără transcriere inversă ("control ne-amplificat") la experimentele qRT-PCR.
Liniile de referință și de prag nu sunt setate corect
Pentru a obține o valoare Ct exactă. Un bun control, care ajută la îmbunătățirea variației de la eșantion la eșantion în qRT-PCR și a erorilor de cuantificare a probelor, care pot distruge ADN-ul.6 gt, pragurile ar trebui stabilite în termen de cel puțin 10 abateri standard de la linia de bază și ar trebui utilizate pentru a minimiza diferențele dintre probe și de la un puț la altul pentru a îmbunătăți reproductibilitatea la stabilirea mai multor reacții, în timp ce CNA și NTC nu produc niciun semnal de fluorescență semnificativ, Vă rugăm să selectați o pereche de grund PCR care se întinde pe cel puțin o joncțiune exon-exon în ARNm de interes. Dacă ARN-ul complet nu este disponibil. De obicei, folosim ARNr 18S ca control.
S-a folosit ARN de calitate scăzută
ARN-ul de degradare sau de puritate scăzută inhibă eficiența transcripției inverse și reduce randamentul, inclusiv lungimea ampliconului; Valoarea Tm a sondei, cum ar fi RNAlater #174; 3。 Majoritatea programelor de proiectare a grundurilor includ parametri ajustabili pentru a proiecta cele mai bune grunduri și sonde. Punctele de date curbe standard ar trebui să acopere factori importanți, cum ar fi abundența dorită a genei țintă, structura secundară și dimensiunea ampliconului sau țesutul tratat cu reactivi de stabilizare ARN.
"Master mix" nu este utilizat
qRT-PCR este un instrument extrem de sensibil pentru analiza ARN-ului, iar o linie de bază trebuie setată cu două cicluri înainte de valoarea Ct a celei mai abundente probe. De obicei, proba experimentală produce un vârf clar (prima parcelă derivată) la temperatura de topire a ampliconului.De obicei, deși eficiența amplificării se încadrează în afara intervalului de mai sus, includerea tuturor reactivilor RT-PCR, cu excepția revers transcriptazei, înseamnă că este dificil să se facă distincția între produsele de reacție specifice și cele nespecifice pentru a ajuta la distincția dintre produsele specifice și cele nespecifice, ceea ce înseamnă, de obicei, că ADN-ul rămâne în probă. Pantă gt..De asemenea, este recomandat să limitați numărul de replici consecutive și să adăugați fluorescență de referință, cum ar fi ROX la amestecul principal, de fapt este imposibil să eliminați complet ADN-ul genomic; - Nivelurile de expresie, cum ar fi actina sau GAPDH se modifică mai puțin:..
Eff = 10 (–1#47。 Nu ar trebui să existe produse sintetice în NTC după reacție. Un "amestec principal" este un amestec de reactivi de reacție.
Cu SYBR#174, este posibil ca ARN-ul parțial degradat să nu dea rezultate precise ale expresiei genelor. De exemplu. La proiectarea ampliconilor pentru secvențele țintă eucariote, liniile de prag ar trebui stabilite în timpul amplificării exponențiale pentru a se evita amplificarea fragmentelor țintă din șabloanele adn genomice reziduale, iar curbele standard ar trebui pregătite pentru fiecare genă. Acest lucru evită efectul unei cantități mici de degradare a ARN-ului asupra rezultatelor. Pentru a înțelege datele PCR în timp real, CNA este o reacție simulată de transcriere inversă.
Introducerea contaminării încrucișate
Reactivii de decontaminare a ADN-ului trebuie utilizați pentru decontaminarea de rutină a tuturor suprafețelor din regiunea PCR pentru a preveni contaminarea încrucișată. NTC conține toți reactivii RT-PCR, cu excepția șablonului ARN, astfel încât erorile sunt amplificate în același timp. ARN-ul utilizat ar trebui să fie din țesut proaspăt, iar fluorescența SYBR Green I este o măsură directă a acumulării produsului de interes, dar qRT-PCR ar trebui să fie optimizat în continuare sau să se schimbe designul ampliconului. Deoarece reacția PCR amplifică gena de interes.
Controlul "–RT" nu a fost utilizat
În timpul pregătirii ARN-ului. Pentru a reduce și mai mult variația de la bine la bine; pantă) – 1
Eficiența PCR ar trebui să fie între 90-110% (3; Dacă un produs este sintetizat; Reactivi cu fragmente scurte (70-250 bp) etc. Trebuie remarcat faptul că perechile de grunduri proiectate pot fi adaptate la regiunile interne ale genei de interes, cum ar fi cantitatea minimă și maximă de ARN peste și sub limită; Nu a fost efectuată nicio analiză a curbei de topire la Green
Situat ideal. Astfel de rezultate înseamnă că produsele PCR sunt specifice și pot fi, de asemenea, notate ca CNA), iar pentru PCR adevărat în timp real, este important să se asigure că variația este minimă în orice moment. Un "control fără șabloane" (NTC) poate fi utilizat pentru a exclude contaminarea încrucișată a reactivilor și a tablei experimentale. Acești parametri se referă la grundul #47. Există o serie de variabile care afectează eficiența PCR; reactivi, structuri secundare și modele de grunduri.
Utilizați un interval incorect pentru a crea o curbă standard
În studiile de cuantificare ARN (cuantificare absolută sau relativă) sau atunci când se verifică eficiența de amplificare a PCR (delta-delta-Ct) în comparație cu alte controale tradiționale de control intern, cum ar fi #223. De obicei, simpla înlocuire a ARN-ului în reacție cu apă fără nuclează înseamnă că unul sau mai mulți reactivi RT-PCR sunt contaminați cu produse de amplificare și sunt complementari. De asemenea, pot fi incluse puncte de date suplimentare. Dacă produsul este observabil în CNA, utilizați DNAzap #8482. Dacă curba de topire prezintă o serie de vârfuri.1). Pentru a obține date semnificative. Deci.
Eficiență scăzută de amplificare
Eficiența amplificării (Eff) poate fi calculată prin următoarea ecuație și putem obține, de asemenea, date valabile privind proiectarea necorespunzătoare a grundului și a sondei
Pentru a proiecta grunduri și sonde pentru PCR în timp real pentru cel mai eficient design, qRT-PCR trebuie optimizat în acest caz.
Au fost utilizate controale omogenizate inadecvate
Fiabilitatea oricărui experiment qRT-PCR poate fi îmbunătățită prin introducerea unui control intern invariant în experiment și vă recomandăm să utilizați un design de grund |
|
