| [Membru (黑面书生)]răspunsuri [Chineză ] | Timp :2016-02-23 | tehnicilor de clonare moleculară (preparare a ADN-ului plasmidic și inserați fragmente de ADN, reacții plasmidă de transformare recombinant și conexiuni)
Clonarea este definit de o moleculă strămoș copiați grupul generat și molecula ancestrală identică de molecule are loc la nivel genetic numit clonare clonare moleculară (clona ADN).
Prepararea (a) ADN plasmidic
(B) insert ADN de la Prepararea 1, reacția transcriere inversă 2, reacția în lanț a polimerazei ADN (PCR)
(Iii) reacția de ligare
(Iv) transformarea plasmida recombinant
Prepararea ADN plasmidic
Plasmida este prezentă în cromozomul bacterian afara buclă închisă de molecule ADN dublu catenar capabile de replicare independentă, ea poate da bacteriene (celula gazdă) fenotipuri specifice. Plasmida nu este necesară pentru dezvoltarea bacteriilor, dar din cauza codificare sale o parte din bacterii benefice din enzimele gazdă, astfel încât bacteria gazdă are capacitatea de a rezista factori nefavorabile, cum ar fi creșterea propriei rezistență și altele. Acum găsit în principal, împărțite în vectorul F plasmidă (plasmida), plasmide R (plasmide rezistență), E. coli plasmida (E. coli enterotoxigenă plasmidă). În funcție de numărul de copii ale plasmidelor într-un ciclu celular poate fi împărțită într-un stringență plasmidă (copie scăzut, copiați o dată sau de două ori) și de relaxare (mare de copii, copie 10-200 de ori). Din moment ce bacteriene plasmidă incompatibilitate de divizat după ce a părăsit-o mare de copii plasmide de numere, cum ar fi plasmide R1 și R2, cu două tipuri de rezistență aparține unei clase, deoarece incompatibilitate încât să nu mai coexista în același bacterii, dar grupuri diferite de plasmide pot coexista într-o bacterie.
Plasmida prezent în bacterie, deci prepararea ADN plasmidic, bacterii plasmide conținând ar trebui mai întâi crescute până la faza log, astfel încât plasmida este amplificat in bacterii într-un mediu lichid care conține antibioticul corespunzător.
Bacteriile au fost colectate prin centrifugare, bacteriile prin liză alcalină, plasmida și ADN cromozomial bacterian denaturat, iar apoi se adaugă soluția, soluția a fost returnat la valoarea pH neutru, astfel încât să poată plasmidic renaturare ADN de conformație dublu catenar la starea naturală, iar bacteriile cromozomiale ADN nu sau aproape așa mai poate în repliere stare denaturată, acestea ADN cromozomial denaturat si proteine denaturate împletesc ușor plasa centrifugare, iar ADN-ul plasmidic este încă prezentă în faza apoasă, se usucă pe etanol anhidru ADN plasmidic Shen In cele din urma, acesta poate fi obținut prin centrifugarea ADN plasmidic.
Prepararea fragmentului (două) ADN inserat
insert ADN-ul este că vrem să studieze genele sau aplicație, care urmează să fie clonat sau exprimate gene. Obține o inserție ADN-ul este primul pas în procesul de clonare moleculară. Există mai multe metode de separare directă restricție endonucleazică,
screening-ul bibliotecii, în metoda de amplificare in vitro, metodă de sinteză, în urma reacției în lanț a polimerazei revers -DNA exemplu transcriere a introduce gene exogene obținute metoda insert ADN. |
|
